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2019-03-08 13:26

  东方心经马报ab黑白11465期藏宝玄机图资料红财神报www.770878.com参考湿疹血小板减少伴免疫缺陷综合征(WAS)的基因治疗临床试验,制定了符合药品生产质量管理规范(GMP)的慢病毒生产工艺。该工艺是基于瞬转细胞工厂中培养的HEK293F细胞。收集病毒上清可以达到50L,然后经过一系列膜及色谱纯化,收集水泡性口炎病毒糖蛋白型假病毒颗粒。该工艺可以将病毒浓缩200倍,并且杂质蛋白及DNA可以降低三个数量级。在六次大规模生产中,收集的病毒颗粒转染效率平均为13%。终产品中含有少量污染物,源于生产细胞的SV40大T抗原或宿主EIA序列。感染性病毒颗粒滴度高达2*109/ml。每批次可以生产6*1011个感染性病毒颗粒。纯化的WAS载体是具有生物学活性的,可以在WAS缺陷的B细胞系中插入的目的基因及高效表达并且可效转导CD34+细胞。以滴度为108个感染性病毒颗粒/ml感染CD34+细胞时,平均每个细胞含有0.3-1个载体考贝数,可以用于临床前应用。没有显示细胞学毒性。综上,来源于晚期HPV-1型病毒的慢病毒,其大量GMP制备、纯化及控制,是可行的。WAS载体的结果在初始小批量生产和质量控制有指导意义,有助于进一步研发及临床应用。

  用于基因治疗的临床级逆病毒载体生产已经应用于一些病症,这种病毒载体修饰体细胞需要具有基因稳定性。γ逆病毒载体是首次应用于治疗严重联合免疫缺陷患者。如今,基于更加复杂的慢病毒设计的其他逆病毒基因转导载体,如人免疫缺陷病毒(HIV)-1,已经在临床上用于治疗遗传性疾病或HIV感染。作为整合型基因转导的工具,基于HIV设计的载体具有RNA基因组稳定性及转导非细胞,优于γ逆病毒载体。多年以来,重组HIV(rHIV)病毒载体技术是安全的并且复制型基因转导系统,通过删除长未端重复(LTRs)的增强启动子序列,使病毒基因最小化,这样的设计可以防止插入基因组重组,防止失活病毒(SIN)再复制。在SIN载体中,可选择内源启动子调控目的基因,即通过内源启动子调控内源基因,同时启动目的基因表达,最小化插入突变的风险。

  湿疹血小板减少伴免疫缺陷综合征(WAS)是采用源于HIV的慢病毒载体基因治疗的候选疾病。WAS是罕见的原发性免疫缺陷,其特点是血小板减少,复发染,湿疹。并且WAS具有较高的概率伴发自身免疫性疾病及淋巴系统恶性肿瘤。临床前试验表明体外基因转导自身造血干细胞是安全有效的。其采用的是第三代SIN rHIV-1来源的慢病毒载体转导,假病毒颗粒含水泡性口炎病毒糖蛋白(VSVg),内源性WAS启动子调控人WAS cDNA表达。对于治疗缺乏同种异体骨髓移植供体的严重WAS患者,这些结果为临床基因治疗研究奠定了理论基础。参考临床试验,本研究开发了符合GMP规范的大规模制备rHIV载体工艺。

  据了解,几乎没有关于在GMP条件产rHIV的操作规范。在实践中,只批准一个批次的慢病毒载体应用于临床。rHIV临床载体生产方法目前主要是共转染2-5个质粒,这些质粒编码辅助性病毒蛋白或者目的基因。为了规避这种复杂工艺,已经报导一些稳定生产rHIV病毒的细胞系,但是都不符合GMP。因为293T细胞在生产rHIV方面的优势,所以仍然主要采用瞬转293T细胞的方法。所悉,生产rHIV病毒细胞系,没有与其他细胞进行比较的报导。一些衣壳糖蛋白可以用于包装rHIV假病毒颗粒,但是广泛应用的是水泡性口炎病毒G糖蛋白(VSVs),因为其宿主比较广泛。另外,从生产的角度而言,这种rHIV假病毒耐反复冻融,并且在浓缩和纯化时,具有良好的稳定性。因此适合在GMP条件产稳定、特征明确的产品。为了提高原始细胞转导效率,通常需要高浓度的rHIV颗粒,需要下游工艺浓缩病毒上清液。离心相对而言是的浓缩方法,如通常采用的超速离心法,也用于离心细胞碎片,细胞膜组分,胞内及胞外(分泌至培养基)的蛋白。这些成分对靶细胞是有毒性的,尤其对原始细胞。如果应用于体内,可能引起炎症或免疫反应。因此除了浓缩,制备无毒性,成分更明确的rHIV颗粒纯化样品也是必要的。

  本论文报导50L规模 rHIV生产,纯化采用常规的膜分离技术,离子交换色谱及凝胶过滤层析。该工艺生产的载体已经应用于WAS患者治疗。与科研级慢病毒载体制备相比,本文详述了在GMP条件产的批次特点,体外功能评价及临床应用中必不可少的安全参数。

  复制型慢病毒(RCL)分析方法见Escarpe 及同事所述。阳性对照是共转染野生型HIV-1型前病毒质粒和编码衣壳糖蛋白的质粒。其中,前病毒质粒缺少辅助性病毒基因(DvifDvprDvpuDnef),编码衣壳糖蛋白的质粒必须与生产假病毒颗粒的载体一致。根据报导(Escarpe et al., 2003),结合VSVg假病毒载体生产实际情况,推测该分析方法的灵敏度约是,每T-175培养瓶含有的半数组织培养感染剂量(TCID50)是2*108个转导单位。

  载体中E1A和SV40大T抗原序列是采用qPCR法,分别性扩增64bp E1A序列和112 bp SV40大T抗原序列。E1A和SV40大T抗原序列测定实验中,在提取之前,均加入内参。量化内参可以提高DNA提取效率并使PCR扩增标准化。E1A和SV40大T抗原序列测定定量的限度是5000 考贝/ml。

  将载体转染C8166-45细胞后,细胞扩增共计29天,六个重复。DNA污染物的的测定是采用qPCR法。检测VSVg时,采用pMD.G质粒制作标准曲线大 T抗原时,采用pTOPO_ALB_E1A 和 pTOPO_ALB_AgTSV40质粒制作标准曲线。pTOPO_ALB_E1A 和 pTOPO_ALB_AgTSV40质粒包含一个细胞蛋白基因(白蛋白)及一个考贝E1A或一个考贝SV40大T抗原。100ng基因组DNA中性序列,根据实验的不同,检测限度从20-1000考贝不等。

  FIG.1 WAS载体整合进靶细胞后的前病毒序列示意图。HIV,人类免疫缺陷病毒。Psi,衣壳包装序列。PBS,引物结合位点序列。LTR,长末端重复序列,5’或3’端。HIV R,HIV R区。HIV delta U3,经过删除的U3区带。RRE,Rev反应元件。cPPT cts,中央聚嘌呤—中央末端序列。hWAS,人WAS基因。WPRE m6,突变的土拨鼠肝炎病毒后调控元件(Zanta-Boussif et al., 2009)。彩图来源网址。

  载体假病毒颗粒感染WAS蛋白阴性细胞B-LCL条件是:0.2ml/孔,2.0*105个细胞,加入5-二氮十一亚甲基聚甲溴化物(6 mg/ml)处理6小时。载体浓度变化从0.05 至10_107 IG/ml,感染复数(MOI)变化从0.5至450。转导后,洗涤细胞并培养8-10天,每三天添加新鲜培养基一次。WASP的表达检测按照文献(Charrier et al., 2007)采用免疫印迹法。

  VSVg假病毒WAS慢病毒载体,已经有报导( Charrier et al., 2007; Galy et al., 2008),开发用于体外转导患者自身CD34+细胞,引导基因组整合5.9kb表达表达元件,表达WAS蛋白(Fig. 1)。从生产用于临床研究的角度,这种载体生产规模按照如下参数推断。考虑到20Kg年轻患者接受5*106 CD34+细胞/Kg,MOI固定为50。那么每名患者约需要感染载体5*109假病毒颗粒。为了制备一批载体用于治疗数名患者(至少5名),考虑到质量及法规,GMP 质量控制将消耗一批中的一半,因此每个批次至少生产5*1010个rHIV病毒颗粒。按照经验(Kutner et al., 2009),转染293T细胞后,每毫升可以产生约107个具有感染力的VSVg假病毒颗粒包装的rHIV 载体。考虑到纯化及浓缩步骤产率约10%,估计每个批次需要50L病毒上清液。这种规模的生产可以采用10层细胞工厂(CF10)培养生产细胞,病毒上清生产流程是在闭完成的,可以符合GMP(Przybylowskiet al., 2006)。此外,从组织培养过程而言,这些容器直接放大转染,与表面积成正比。

  HEK293细胞及其衍生细胞293T均瞬转用于生产慢病毒。虽然293T细胞相比其HEK293细胞应用更广泛,但作为母本的HEK293细胞在安全方面更具优势,因为HEK293细胞缺少SV40大T抗原(SV40 LTA)编码基因,该基因属于癌基因。因此构建eGFP,在T-75瓶或CF10瓶中小量生产,比较HEK293细胞和293T细胞生产慢病毒的能力,进行快速评估。正如预期,293T细胞比HEK293细胞明显复制周期短(19 vs. 25 hr)。转染24小时后,293T细胞中eGFP+细胞明显多于HEK293细胞,表明293T细胞具有较高的转染效率(结果未显示)。在未经优化的条件下,293T细胞比HEK293细胞病毒上清效价更高(293T细胞,在T-75系统1.2*107 ,在CF10系统 3.7*106 TU/ml 。HEK293细胞,在T-75系统2*106,在CF10系统9.9*105TU/ml)。与受青睐的293T细胞相比,HEK293细胞在CF10系统中未能充分提高病毒生产或滴度。在最优条件下采用eGFP,293T细胞所需载体总量比HEK293细胞高四倍(1.74*1010 vs. 4.59*109 TU)。此外,就载体转染效率而言,293T细胞比HEK293细胞高两倍。这些结果,使得慢病毒生产工艺研发采用293T细胞。细胞中出现SV40大T抗原这种特殊污染物,需要在载体生产中其含量。为了生产临床级载体,293T细胞工作细胞库是在GMP中制备的并且得到认证。

  rHIV慢病毒颗粒生产工艺流水线操作是为了减少操作步骤及促进工艺符合GMP要求。公开的操作规范基于磷酸钙法转染293T细胞并且只收集两次(每天一次)就可以扩大到24个CF10培养瓶,可以生产48-50升病毒上清。生产WAS载体的质粒浓度与数量是在一个瓶中进行优化的,放大是在相应的24个CF10培养瓶进行的。根据其他公开操作规程,WAS转移质粒浓度是超过其他质粒浓度的。矩阵实验中,四质粒系统中每一个质粒浓度都是变化的。变动设置值的0.5至3倍,对WAS LV滴度没有影响,例外是VSVg质粒量大时滴度有下降,这与其他人的实验结果一致。采用相同的工艺流程大规模制备六批WAS载体,得到的原始病毒上清液效价范围是1-5*107 IG/ml,优质病毒颗粒感染力范围从0.4*105至1.4*105IG每钠克P24(Table 1)。但这些病毒上清液也含有污染物。在研发阶段四个实验当中,初始总蛋白浓度是6.14±1.47 mg/ml,最初总DNA浓度是1.97±0.0 mg/ml。因此在启始物料中,每108IG,蛋白浓度平均值是21.4mg,DNA浓度平均值是6.9 mg。

  下游工艺操作规程正如其目的:病毒载体的纯化和浓缩,去除工艺及细胞来源的杂质,最终制成临床级载体制剂。在临床前研究中,当使用WAS慢病毒载体,浓度为0.5-1*108IG/ml时,WAS表型具有较高正确率。因此本研究计划生产载体终浓度至少为2*108IG/ml。从GMP应用的角度,结合自己经验及先前发表的逆病毒或慢病毒纯化研究,采用多步纯化及浓缩。我们自身经验是一些色谱法及基于膜的工艺步骤具有优势。该工艺成功应用于六批大规模质粒生产(Table 1)。其中四批是在研发阶段的标准条件下制备的。最后两批因为计划用于临床,所以按照GMP生产,与另外四批使用的细胞与质粒是完全一样的,不同的只是最后两批的生产使用的材料是GMP级别的。

  第一步,病毒上清液通过降低孔径的低截留膜过滤器(0.8um降至0.45um)预处理。然后,滤过液经核酸内切酶(Benzonase) 4℃过夜,以去除质粒及其他DNA污染物。具有感染力的病毒颗粒,收集到约三分之二,经过膜处理和DNA酶处理,感染力下降不足2倍(Fig. 2B),降低了产品85%的DNA含量(Table 2)。阴离子交换色谱法是纯化逆病毒非常有效的方法,也采用该方法捕获病毒颗粒。病毒上清液通过DEAE离子交换色谱柱纯化,PBS洗涤、2L氯化钠洗脱。该工艺步骤去除99%以上的总蛋白质(Table 2)。洗脱液通过切向流过滤去盐并浓缩约20至30倍,VSVG-假型慢病毒颗粒具有较高的产量。在这一步,通过中空纤维管束产生约70ml产品。进一步减少蛋白质和DNA污染物(Table 2)。最后,浓缩病毒悬液通过排阻色谱法(载样体积:柱体积=0.15)置换至制剂培养基(X-VIVO 20)。约200ml收集液通过0.2um胶囊式过滤器除菌,过滤器再经约40-50ml 载体制剂培养基清洗,终产品体积约250ml。这步工艺,体积浓缩了200倍,总蛋白和DNA污染物减少了三个数量级,每毫升残留蛋白量为1.38±0.3mg,每毫升残留DNA量为1.38_1±24 ug(Table 2)。下游工艺将总DNA量降至0.6–3.2 ug/ml,最后108 IG含DNA 0.023–1.1 ug (Table 1)。去除DNA最有效的步骤是核酸酶处理(去除85.4±1.93%)和切向流过滤(去除14.5%),去除总DNA的98.97±0.83%。去除蛋白最有效的步骤是DEAE色谱法,去除了99.85±0.09%的总蛋白。总蛋白约去除了700倍(Table 2)。下游步骤没有明显的去除效果,因为因为制剂培养基中含有蛋白质。在排阻步骤中,载体制剂使用的X-VIVO 20培养基所含蛋白量大于1.12mg/ml,因此残留蛋白水平在最终产品中有所提高。在研发阶段,每毫升终产品中含有蛋白1.38±0.30mg(每108 IG含蛋白0.74±0.29mg)(Table 2),在GMP条件下,每毫升终产品中含有蛋白1.35和1.4 mg(每108 IG含蛋白不足0.1mg)(Table 1)。当考虑添加X-VIVO 20培养基,并扣除培养基中蛋白,可以估算出,每108 IG含蛋白0.12±0.14mg(Table 1)。考虑到最初病毒上清液中,每108 IG中有21mg 蛋白质,这些数据表明该工艺可以有效去除蛋白质,使病毒颗粒得以纯化。无论是否统计最后制剂培养基中的蛋白质,两批次终产品中,每108 IG,分别含蛋白0.74±0.29 或 0.12±0.14mg。远小于Schonely及其同事的蛋白质污染含量(每108 IG中蛋白质含量小于7mg )。

  综上,六批大规模生产,该工艺达到最初的2*108 IG/ml,病毒颗粒的感染力大于1*104 IG/ng p24。但总产量不高,只有10%。每批次可以生产高达5*1010 IG,因此可以达到最初。然而,GMP条件产的两批产量超过最初,较高载体效价(109 IG/ml),高的感染力(4*104 IG/ng p24),较高产率(16–23%),每批可以产生2–6*1011 IG(Table 1)。

  在工艺当中,最重要的浓缩是离子交换色谱及超速离心,分别提高感染力67±23倍和163±113倍,这两种方法在研发及GMP生产都会涉及到(Fig. 2A)。在相应的步骤中,物理颗粒滴度也在增加。在最后步骤中,发现效价降低,可能是载体稀释及载体轻微吸付到除菌膜。阴离子交换色谱纯化后感染力有所降低(IG/ng P24 比值),在超速离心步骤时感染力有所回升。这种原因可能是柱洗脱时需要增加盐浓度,盐可能影响qPCR法检测感染滴度,但不影响ELISA法检测物理滴度。确实,下游的DEAE色谱法中,感染性基因组与纳克P24蛋白比值有所提高(Fig. 2B)。研发与GMP生产有两外不同:第一,工艺开始时,六合特码部姐彩色图库六合彩13开奖结果3388tt.com 黄大仙六合彩网站GMP生产具有较高的病毒上清滴度。第二,GMP生产比研发而言,切向流过滤收率稍高(Fig. 2A)。综上,初始体积与终产品比值,研发阶段的载体(感染力)质量下降40%,GMP生产当中下游工艺保持病毒颗粒感染力相当稳定 (Fig. 2B)。

  FIG.2 研发阶段大规模生产及GMP生产下游工艺步骤分析。(A)在研发(虚线)或GMP生产(实线)中WAS慢病毒载体生产工艺各环节,平均感染滴度(IG/ml; 圆圈)和P24滴度(ng p24/ml; 方形)。(B)颗粒感染力下游工艺各步骤中以IG/ng p24表示,计算与初始病毒上清百分比。

  a 第二、三列标出了每步工艺中理论体积与浓度。研发阶段四批大规模生产中蛋白质和DNA含量,是通过测量实际加工与收集产品的体积,计算去除效率。平均启始总蛋白浓度是6.14±1.47 mg/ml,平均启始DNA浓度是1.97±0.0 ug/ml,最终总蛋白浓度是1.38±0.3 mg/ml(包括制剂培养基中加入的蛋白量),最终总DNA浓度是1.38±1.24 ug/ml。

  在工艺控制过程中测量,发现下游工艺分别减少总DNA 1000倍及蛋白量700倍(Table 2)。为了促进终产品转导造血干细胞,因此终产品溶解于 X-VIVO 20 培养基,每毫升培养基中约含1.1mg蛋白。生产培养基,生产细胞,或者工艺也可能出现其他蛋白污染物,可能对患者使用产品造成一定的。因此在研发阶段检测特定污染物,为GMP生产提供参考。工艺副产物之一是核酸酶Benzonase,在工艺启始以5ng/ml的浓度与病毒上清共孵育,因此相当于每个批次额外加入了2.5*105单位核酸酶。这种外源性酶,是载体生物活性不需要的,在工艺下游是要去除的。最终的纯化与制剂产品,不论研发还是GMP生产,都是检测不到的核酸酶的(Table 3)。牛血清白蛋白在病毒生产培养基中常用浓度是2.5mg/ml,终产品中其浓度不足500ng/ml,表明该蛋白质去除效率至少5000倍(Table 3)。源于生产细胞的总宿主蛋白检测是通过HEK293性ELISA实验,发现有少量残留,未超过200ng/ml。

  生产细胞的产物SV40大T抗原(SV40 LTA),在许多细胞中都有致癌性。病毒上清超速离心后采用western blot,可以检测到浓缩慢病毒载体中SV40 LTA的残留(Fig. 3).。相反,同样采用western blot,载体纯化采用多步膜过滤和色谱法,未检测到SV40 LTA残留。所有纯化或超速离心样品含有等量的病毒颗粒,见HIV p24 和 p17免疫印迹图谱(Fig. 3),表明纯化工艺可以去除该污染物。为了进一步评估产品致癌性,检测了E1A 或SV40 LTA DNA序列含量,这些可能从生产细胞的培养过程中。通过定量PCR,检测到每毫升纯化载体中,检测到E1A含量是0.37-2.4*105考贝,SV40 LTA含量是 0.69-4.2*105考贝。平均每个293T细胞含E1A 6.6考贝,SV40 LTA 2.1考贝。考虑到293T细胞中DNA C值为9.8ng(认为是三倍体细胞),两批GMP生产的载体,包含0.05-2ug基因组DNA/ml。代表着高达70%总DNA(荧光法检测)(Table 1)。残留DNA可能来源于转染细胞用的质粒,为了评估E1A 和 SV40LTA 序列的意义,我们验证了具体多少量可以转染靶细胞并导致感染。本研究用培养型细胞(C8166-45)时加入载体并扩增细胞。第一个检测点是转染后一周,通过qPCR未检测到E1A和SV40 LTA序列信号。因此,载体中少量残留E1A和SV40 LTA序列不会转染靶细胞。该实验中也检测了其他可能转染DNA序列(源于质粒的序列)。未检测到细胞中的VSVg序列(来源于质粒)(Table 3),然而,超速离心制备样品转染靶细胞一周后,可以将这些序列转染进靶细胞(数据未显示)。

  GMP,药品生产质量管理规范。 LTA,大T抗原。 SV40,猿猴病毒40. VSVg 水泡性口炎病毒糖蛋白

  FIG. 3. 慢病毒载体中病毒性蛋白SV40大T抗原检测与鉴定。免疫印迹法中,抗体性检测HIV p24衣壳蛋白和p17基质蛋白(如图所示,条带标出蛋白24KDa与17KDa,marker标示出32KDa与7KDa)及SV40大T抗原(如图所示,下面条带,蛋白量80–95KDa,marker标示出82.5KDa)。1-3号泳道表示研发或GMP生产中rHIVWAS慢病毒载体纯化与生产的一些样品。4-6号泳道表示WAS 或GFP rHIV 载体小规模制备并经超速离心浓缩。293 和293T细胞提取物分别做为阴性和阳性对照。293FT细胞因为高表达SV40大T抗原,也做了检测。

  CA,衣壳。 LTA,大T抗原。LV,慢病毒。MA,基质。MW,量。彩图网络链接。

  尽管慢病毒载体系统有许多安全问题,但必须在许可条件下使用灵敏的方法证明无复制型重组HIV颗粒(复制型慢病毒,RCL)。六批WAS慢病毒载体生产中无RCL,六批生产包括三批小规模,研发阶段一批大规模,两批大规模GMP生产。每个批次中,总体积的5%使用p24衰减法检测,如上所述(Escarpe et al., 2003)。阳性对照是缺乏辅助基因的HIV-1弱毒株,但编码HIV和VSVg衣壳,TCID50 值相当于10-20 fg的p24蛋白。脉冲控制表明,采用该对照,任何批次WAS 没有RCL检测。六批次检测WAS 慢病毒,C8166-45细胞扩增28天后,p24蛋白低于检测限。两批GMP生产批次,检测了感染性颗粒的数量,结果表明,1.25–3*1010 IG中,少于一个RCL,考虑用于临床试验的剂量,这符合监管要求的每名患者少于一个RCL。

  WAS慢病毒载体感染正脐带血干细胞(UCB)CD34+后,对细胞生长、活力与分化无影响表明其无毒性。因为WAS是一种罕见疾病,在临床研究中,这些细胞用做具有代表性的靶细胞。四批大规模研发在13个UCB CD34+样品中检测,载体浓度从1*107至10*107 IG。没有检测到载体对细胞(细胞因子培养)生长与活力有影响。与未转导细胞或超速离心制备的GFP-载体相比,也没有检测到对造血祖细胞集落形成有影响(Fig. 4A)。GMP生产中也有相似结果(结果未显示)。通过检测感染祖细胞后集落分化评估WAS载体毒性。两批GMP生产,每批都经两个浓度检测,每个浓度检测三个UCB CD34+细胞重复样品,没有检测到毒性。Figure 4B表明,与未转导的髓系,红细胞与祖细胞相比,GMP生产的WAS慢病毒载体对细胞数量无影响。研发阶段WAS慢病毒载体也有此现象(结果未显示)。转导CD34+细胞的效率通过检测载体整合到细胞的考贝数。发现载体整合到基因组的浓度剂量依赖效应(Table 4A)。检测的载体最高浓度1*108 IG/ml,平均每个细胞中整合0.3-1.2考贝,与期望值相符,表明GMP生产的载体具有的良好的感染力。

  FIG. 4. WAS 载体对人脐带血CD34+细胞无毒性。(A)CD34+细胞在添加细胞因子的培养基中增殖及载体感染CD34+细胞后。检测了研发阶段四批WAS慢病毒载体生产。每个实验都包括一个对照载体,即通过超速离心浓缩编码eGFP的载体。总共检测了12个脐带血样品,每个批次WAS载体都检测脐带血CD34+细胞1号至6号不同样品。CD34+细胞用不同浓度载体感染后,细胞培养时添加细胞因子并培养8天。结果表明,培养周期结束时,平均增长因子的计算,是培养结束时细胞数量与培养启始数量的比值(左),台昐蓝染色法检测细胞活力(右)。(B)CD34+细胞转导分化实验,即半固态的克隆形成法。两个不同浓度载体转染细胞后,铺板1000个细胞,图中结果是不同类型集落形成单位细胞数量的平均值。在这些实验中,每个载体转染脐带血CD34+细胞后,检测三个平行样品,图中结果为两批GMP生产WAS载体检测平均值。

  BFU-E,红系爆式集落形成单位。CFU-C,集落形成单位细胞。CFU-GM,集落形成单位,粒细胞-单核细胞。CFU-GEMM,集落形成单位,粒细胞、红细胞、巨噬细胞、巨核细胞。GFP,绿色荧光蛋白。IG,感染性基因组。WAS,湿疹血小板减少伴免疫缺陷综合征。

  本研究描述新一代SIN HIV-1来源的慢病毒载体大规模生产及下游工艺。该慢病毒载体已经用于WAS体外基因治疗的I/II期临床试验。结果表明,制备的假病毒颗粒经纯化后高度浓缩、非复制性及具有生物学活性,这对患者采取基因治疗的安全性和有效性具有重要意义。工艺开发和GMP生产得到的最初数据对慢病毒技术具有重要的参考意义,但也表明工艺仍处于开发阶段,慢病毒技术要想在医药界经的住,需要进一步努力加以改进。

  虽然产量不稳定,但生产工艺是符合GMP的并且可重现的,成功应用于50升规模,本研究在研发阶段共生产了四批。连续两个批次WAS载体生产采用GMP级别材料及条件。每个批次分别收获2.6*1011和6.2*1011 IG,代表4.16和6.76mg p24。获得的滴度大于等于109 IG/ml,超过了至少2*108 IG/ml这个终产品限度。每批次应该治疗数名患者,因此每批生产时,使滴度和假病毒颗粒数量最大化。

  根据欧洲药品局(EMA)对慢病毒生产要求(CPMP/BWP/2458/03)和欧洲药典6.6-5156对人用逆病毒载体要求(,两批GMP级别载体采用了大量的分析实验。这些指导意见没有明确的生物学效价或残留污染物含量,与其他基因治疗病毒载体不同,人用逆病毒生产没有制备标准。然而,欧洲药典需要鉴定载体(见Fig. 5),确定基因组整合(结果未显示),载体浓度测量(Table 1)及无RCL。如Tables 1 和 3和 Fig. 3所示,载体制备包含的感染性病毒颗粒具有成熟衣壳,并表现出期望的物理化学性质。至少1*1010IU不能有复制型慢病毒颗粒,因此提供了应用于患者的病毒颗粒安全值范围。假病毒颗粒在细胞(滴度测定用)表现出较高感染率(6*104IG/ng p24)。欧洲药典要求检测残留宿主细胞蛋白、DNA、试剂、质粒,并且这些数据都应该有记录,直到工艺通过清除率验证。本研究,牛源、细胞、质粒来源的污染物较低。EMEA收集的病毒上清用内源性核酸酶处理,去除质粒,尤其编码VSVg 或 Gag-Pol的质粒。这就是为什么将残留VSVg质粒作为质粒DNA污染物的原因。未检测残留抗生素是因为工艺中没有使用到。通过对纯化样品和终产品进行一系列体内外标准微生物实验产品无菌性,未检测到细菌、真菌、支原体及外源性病毒污染物,且内毒素含量较低((10 EU/ml,结果未显示)。根据欧洲药典,产品应符合注射制剂的渗透压、pH、内毒素要求。该工艺生产的产品至少符合体外临床应用。

  有效转导原始CD34细胞证明上述特点,采用最高浓度载体检测,平均每个细胞中整合0.3-1考贝质粒(从整个细胞群体而言)(Table 4A)。这些数值看起来比较低,但是这些载体低考贝数使整合载体的基因毒性降低,小鼠WAS模型的临床前研究为治疗提供帮助。相似的转导数值也出现在其他体外造血干细胞基因治疗模型中,如镰状细胞病或异染性脑白质营养不良。CD34+细胞转导后,每个细胞平均载体考贝数小于1,肾上腺脑白质营养不良患者在临床试验中也是如此。纯化的WAS载体插入基因组的目的基因正常表达。载体完整性通过对前病毒测序进一步得到验证,前病毒会整合入细胞中(结果未显示)。载体产品无毒性,并不影响脐带血CD34+细胞的活力、生长及分化潜能。可以做为患者细胞的替代品。虽然这些实验非常具有指导意义,但载体的实际毒性与转导效率仍然需要在临床患者细胞中进行检验。

  GMP,药品生产质量管理规范。IG,感染性基因组。UCB,脐带血。WAS B-LCL,湿疹血小板减少伴免疫缺陷综合征B淋巴母细胞系。

  FIG. 5 GMP级别WAS慢病毒载体转导后,插入基因的表达。WASP载体以不同浓度感染WASP-阴性 04W B-LCL细胞(1号样品为GMP生产)。八天后,免疫印迹法检测细胞提取物,抗体是抗WASP 和 actin。阳性对照是正B-LCLs。其WASP 含量与actin含量之比是1.0。上图结果代表两个批次GMP样品检测。B-LCL,淋巴细胞系。IG,感染性基因组。WAS,湿疹血小板减少伴免疫缺陷综合征。WASP,WAS蛋白。VCN,载体考贝数。

  该研究报导是治疗WAS的第一批慢病毒载体,也是首批报导关于临床级HIV-1来源慢病毒大规模纯化及特点。为了得到满意的纯化产量、浓度及生物活性产品,通过详述生产和下游工艺操作,对临床级慢病毒生产具有重要参考意义。一些要点对操作是十分关键的。生产细胞是一个重要因素,可部分影响病毒上清的产量和质量。正如我们在GMP生产所见,这是重要的一环。与HEK-293细胞相比,选择293T细胞完全是基于病毒颗粒的高产量与感染力。其他细胞,如293FT也有测试,但在应用方面没有任何优势(结果未显示)。这与实际情况是相符的,即293T细胞是最常见的rHIV慢病毒载体生产细胞。并且通过不断提供293T细胞实验条件和数据,促进临床前向GMP。生产细胞的转染条件,如质粒比,细胞浓度,病毒上清收集时间,很大程度上是参考Naldini及其同事报导的操作规范,并且也应用于大规模生产。本研究及其他研究组也发现相似的结果,即使用较低的VSVg编码质粒但浓度高于转移质粒及转移质粒5’LTR高表达系统。另一关键点是下游工艺放大,不仅提高了产品浓度,也提高了安全性。γ逆病毒研究表明,在对患者使用未纯化质粒时,像牛蛋白这样的副产品,即使体外应用和治疗免疫缺陷患者,也会引起首次免疫反应。此外,VSVg假型慢病毒的纯化,以除去多聚体,细胞碎片及组织培养基(动物体内注射会引起炎症反应),是十分关键的。本研究开发的下游工艺操作与已报导的大规模操作(Slepushkin et al., 2003; Lu et al., 2004)是相似的,虽然某些步骤顺序是相反的。下游工艺是可行的,整体而言,去除三个数量级的蛋白质与DNA污染物,减少了潜在的致癌序列,酶及质粒DNA。免疫印迹法检测不到SV40 LTA。此外,ELISA法检测 SV40 LTA表明,其低于这种方法的检测限(结果未显示,与M. Radrizzani私人交流)。本课题组曾采用双向电泳及基质辅助激光解吸和电离飞行时间(MALDI-TOF)研究慢病毒颗粒纯化样品蛋白组成。检测到某些相关蛋白及包裹在颗粒内部的少量蛋白,未检测到E1A, E1B 或 SV40 LTA。相反,可以用qPCR法检测终产品中SV40 LTA和E1A DNA序列。通过计算,这只是产品中总DNA的一部分。通过PCR扩增法检测,并不能确定编码蛋白质的潜能,确切说,这些序列并未转入靶细胞,见Table 3。发现癌基因PCR信号也不清楚其在功能方面有什么意义,因为经核酸酶(Benzonase)的处理,局部扩增不能体现完整阅读框(ORF)的存在。风险看起来比较低,尤其是体外应用。rHIV基因转导技术应用于治疗疾病之前,提高安全还是有必要的,除非治疗严重危胁生命的疾病。

  其他研究组(Slepushkin et al., 2003)的工艺回收率约30%,比本研究工艺回收率要高。这可能是因为本研究采用尺寸排阻色谱法及不同的分离介质有关,如色谱矩阵和超滤滤芯。采用该工艺,在工艺开发和技术转移阶段,在大多数标准化运行中,均获得了每个批次最小理论收获载体量。研发阶段最后一个批次载体浓度(2_108 IG/ml)与已报导大规模生产相当,这些大规模生产采用色谱、过膜或超速离心的方法。但是,因为没有标准的方法,很难精确比较这些方法的滴度。GMP具有正面效果。采用GMP级别材料,连续两批GMP生产获得稳定高产。GMP生产得到的载体浓度109 IG/ml,比任何报导都要高,可能因为病毒上清IG有2-2.5倍提高及改善超速离心条件,在最后除菌过滤步骤稍有提高,见Fig. 2。从这点而言,该工艺在大规模生产及GMP生产是可行的。虽然该工艺可以满足需求,但进一步提高工艺效率、产量及耐用性,仍有空间。该研究为未来慢病毒生产质量控制制定首批生物技术参考规范,也为未来改善慢病毒生产奠定基础。

  几乎没有文献(除了Schonely et al., 2003)报导放行标准,本研究在这方面提供数据。本研究将研发阶段大规模生产技术转移至GMP生产,以建立临床产品生产标准。本研究采用的标准比已报导的(Schonely et al., 2003)更加严格。最大区别是残留内毒素(100vs. 10 EU/ml; 结果未显示)和残留核酸酶含量(100 vs. 0.2 ng/ml)。残留蛋白含量,不管是否考虑终产品制剂培养基(每108IG,分别是0.74±0.29 或 0.12±0.14mg蛋白),都远远低于Schonely及其同事制定的标准,即蛋白污染物含量7mg/ml。本研究的感染滴度标准(IG/ml) 2*108 IG/ml,是Schonely及同事标准的20倍。将来,生产其他批次WAS载体或其他类型慢病毒载体,需要其他措施评估GMP生产的熏复性,以符合相应标准。

  该研究为未来研发符合或改进工艺提供参考。本研究建立的病毒上清生产对下游工艺成功是很关键的,因此与目前方法相比,可以进一步优化病毒上清制备。本研究采用磷酸钙做为转染试剂,因为其既简单又符合GMP。一些课题组(Devitt et al., 2007; Kuroda et al., 2009)采用聚乙烯亚胺做为较强转染试剂。这些转染试剂也可以用于悬浮培养的HEK293细胞,在生物反应器中培养,病毒上清滴度达108 TU/ml。虽然目前工艺可以有效去除DNA,但终产品中其浓度仍然在微克每毫升。可以通过优化核酸酶(Benzonase)进一步更加完全地去除DNA污染物,这是该工艺去除DNA的关键一步。为了更加深入了解污染物,其他分析方法也是需要的。从药物申报和申请rHIV体内基因转移技术角度而言,这种改善是有必要的。进一步优化工艺会降低载体损失并提高产量,尤其是优化离子交换色谱、超滤/渗滤步骤。有些课题组(Segura et al., 2007)采用肝素亲和色谱成功纯化VSVg假型rHIV载体。但是这些纯化的载体颗粒的特点及生物检测并没有报导。

  总之,在功能与高质量方面,大规模生产(非GMP及GMP)的WAS慢病毒载体特点与研发级别载体相当,并且生产工艺可以制备的临床级载体产量和质量。正在计划用于WAS患者治疗的I/II期临床试验。

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